PS：循环肿瘤DNA（ctDNA）是目前的研究热点，能解决这个问题，也确实能给临床决策带来指导，能在术前更全面的评估肿瘤突变情况，针对性的精准的手术切除，用现在新冠下时髦的词说就是“关口前移”。

年2月发表于CriticalReviewsinOncologyHematology的一篇综述回顾了目前胶质瘤ctDNA的研究情况。

热点

循环肿瘤DNA（ct-DNA）的液体活检代表了用于神经胶质瘤遗传诊断的有前途的工具。

ct-DNA的血液水平通常较低，仅在少数神经胶质瘤患者中可检测到，这可能是由于血脑屏障的存在。

胶质瘤患者的ct-DNA最佳来源是在外科手术过程中或通过腰椎穿刺收集的脑脊液（CSF）。CSFct-DNA的检测和分子分析可以通过基于PCR的方法或基于NGS的技术进行。

CSFct-DNA液体活检将极大地帮助胶质瘤临床管理的每个步骤：无法手术时的分子诊断、监测肿瘤反应、早期复发检测、追踪复发时的纵向基因组进化以及针对靶向治疗的选择。

摘要

无细胞循环肿瘤DNA（ct-DNA）反映整个肿瘤的空间和时间异质性是目前神经胶质瘤液体活检策略最有希望的候选方法。与其他实体瘤不同，由于血液水平通常较低且仅在少数病例中可检测到，因此，ct-DNA胶质瘤患者的最佳来源是脑脊液，现已被广泛接受。脑脊液ct-DNA液体活检方法实际上可以支持神经胶质瘤治疗的所有阶段。

2、液体活检在神经胶质瘤分子分析时代的潜在应用

既往中枢神经系统（CNS）恶性肿瘤的诊断主要基于组织病理学特征。然而，在过去的十年中，大规模的DNA测序工作已经可以鉴定出几个关键的基因组改变。目前，代表成年人最常见的原发性脑瘤（PBT）的恶性弥漫性神经胶质瘤根据IDH突变可分为两个主要亚组。原发性胶质母细胞瘤（GBM）通常缺乏IDH突变，但经常具有EGFR扩增和/或突变（EGFRvIII）和端粒酶逆转录酶启动子（TERTp）突变，以及7号和10号染色体的重排。包括WHOII级和III级在内的较低级神经胶质瘤通常是IDH突变的肿瘤：星形细胞瘤携带TP53突变和α-地中海贫血/智力低下综合征-X连锁基因（ATRX）丧失，而少突胶质细胞瘤则表现为1p/19q缺失和果蝇的同源基因CIC，上游结合蛋白1（FUBP1）和TERTp基因的频繁突变。小儿弥漫性中线神经胶质瘤的特点是组蛋白脱乙酰基酶基因H3F3A和HIST1H3B发生突变，而毛细胞星形细胞瘤，绒毛状星形细胞瘤，神经节神经胶质瘤和多形性黄色瘤型星形细胞瘤常在BRAF基因中发生突变。这些进展导致年WHO分类的重大更新，引入了IDH突变状态，除组织学外还存在1p/19q共缺失定义神经胶质瘤亚型。除了其诊断作用外，目前尚可预测其中一些遗传标志物的临床相关性：IDH突变代表弥散性胶质瘤患者中最有力的良好预后因子，而最近已发现依赖环素的激酶抑制剂A和B的纯合缺失（CDKN2A/B）状态在IDH突变的神经胶质瘤中，它被认为是强有力的不良预后指标[8]。目前，唯一公认的预测因子是O（6）-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）启动子甲基化，其与替莫唑胺（TMZ）反应相关。PBT的新药开发领域也正在取得进展，这些生物标志物以及新发现的生物标志物将在不久的将来用作选择因子，以识别个性化疗法的候选者。例如，目前正在开发特定的IDH抑制剂，而抗EGFR药物GBMs的抗体-药物偶联物depatuxizumab正在后期临床试验中进行评估。烷化剂和放疗（RT）引起的错配修复（MMR）系统突变可能会改变突变负担，并赋予免疫检查点抑制剂以敏感性。然而，在中枢神经系统恶性肿瘤的情况下，由于侵入性进入和通过分析小组织碎片来概括整个肿瘤异质性的问题，肿瘤取样存在多个局限性。此外，在复发的情况下很少进行高风险的手术，从而排除了检测复发性肿瘤的新的分子特征的可能。由于所有这些原因，能够提供遗传特征的微创工具（例如ct-DNA液体活检）将极大地帮助临床医生管理这些患者。ct-DNA由凋亡肿瘤细胞脱落的短片段（-个碱基对）组成，并具有相应肿瘤的遗传和表观遗传畸变。在血液中，ct-DNA仅占总无细胞DNA（cfDNA）的一小部分，大部分是由正常死亡的细胞释放的。由于高度敏感的基于PCR的技术，例如液滴数字PCR（ddPCR）和颗粒，乳剂，扩增，磁性（BEAMing）数字PCR，基于血浆ct-DNA的液体活检已被证明在许多其他实体瘤中具有丰富的信息，可以追踪变化肿瘤负担和突变模式。除了这种靶向方法外，尽管分辨率较低且成本较高，但全基因组测序或全外显子测序（WGS，WES）可以在没有先前信息的情况下全面鉴定遗传变异，也已成功实施。

3、早期的基于血液的方法：

从乐观到失望的过去几年中，PBT中循环生物标志物的理想来源一直是许多争论的主题。至于其他实体瘤，由于直观的优势，例如快速无创收集以及能够概括相应肿瘤的遗传特征的能力，外周血是被研究的ct-DNA的第一个来源（表1）。在CNS恶性肿瘤中评估血液cf-DNA的开创性经验可以追溯到本世纪初，并且其重点是通过基于实时PCR的检测来检测一系列神经胶质瘤自身的基因组特征，例如表观遗传学改变或杂合性丧失（LOH）。3年，Bala?a等人。评估了接受Carmustine或TMZ加顺铂治疗的28名GBM患者的肿瘤和血清DNA中特定基因的甲基化状态，包括MGMT，p16，DAPK和RASSF1A的甲基化状态，发现cf-DNA甲基化与匹配的肿瘤组织样品之间存在高度一致性。其他小组评估了小系列的PBT和转移灶也报道了可比较的结果，其特异性非常高，接近％，但敏感性不令人满意。依据这些早期工作，Lavon等人，研究了来自70个受不同程度星形胶质细胞和少突胶质细胞瘤影响的患者队列中成对的肿瘤血清样本中MGMT和PTEN基因、1p，19q和10q缺失以及甲基化状态。同种异体树突神经胶质瘤和80.5％的星形细胞瘤显示至少一种肿瘤特异性畸变（LOH和/或基因甲基化）[16]。然而，这种血型变化的检出率再次适度，LOH和甲基化状态分别为51％和55％，这使得测试相对不敏感。

年，Boisselier等人。首次尝试检测血浆ctDNA中的神经胶质瘤特异性突变。IDH1RH替代是液体活检方法的“理想”候选者，因为它很频繁（占所有神经胶质瘤诊断的40％），它是弥漫性神经胶质瘤最强的独立预后因素，现已成为低级神经胶质瘤的诊断标志。收集和分析80例神经胶质瘤患者（28例WHOII级，42例WHOIII级，10例WHOIV级）和31名健康对照的血浆样本，并结合使用COLDPCR（在较低变性温度下进行共扩增）来进行分析，该方法优先扩增突变体DNA和digitalPCR，这是检测IDH1RH突变的高度灵敏方法。25个突变的肿瘤中，总共有15个在血浆中表现出突变（与14个非突变的肿瘤中没有一个相比），对高级别胶质瘤（HGG；WHOIII和IV级）的敏感性随着肿瘤体积的增加而增加[17]。与这些早期发现相一致的是，随后的两项研究对大量肿瘤类型广泛的患者队列中的血清ct-DNA进行了评估，明确表明血液并不是PBT液体活检的最佳来源。Bettegowda等利用靶向测序，WES或WGS来全面表征例各种癌症类型和不同阶段的患者（包括41例PBT患者）的血浆ct-DNA。总体而言，在大多数转移性癌症患者（胰腺癌，卵巢癌，结直肠癌，膀胱癌，食管癌，乳腺癌，黑素瘤，肝细胞癌和头颈癌）的血液中发现了相对较高浓度的突变DNA片段[18]。相反，在27例低级别神经胶质瘤（LGG；WHOI级和II级）或HGG患者中，10％的患者和在14例髓母细胞瘤患者中50％的患者血浆中可检测到ct-DNA水平。Schwaderle等通过使用digitalNGS并使用不同大小的基因组（包括最常见的癌症相关基因）分析了个血浆样本中的ct-DNA，包括个（22.7％）PBT，在这项研究中，只有32％的PBT患者表现出至少一种ct-DNA体细胞突变[19]。其中，4％与FDA批准的药物相关，11％与实验药物相关，而85％具有不可操作的改变。为了解释PBT患者血液中可检测到的DNA改变的相对稀有性，有人提出血脑屏障（BBB）可能会阻碍肿瘤生物标志物有效地渗入血液。

4、脑脊液是恶性神经胶质瘤中ct-DNA的主要来源

考虑到其在解剖上与脑实质的接近性，以及对诊断中枢神经系统其他病理状况的有用性，脑脊液已被用作ctDNA的替代来源。脑脊液由脑室的脉络丛中的特有的室管膜细胞产生，每天更新3至5次，充满脑室，脑池和脑沟，以及脊髓的中央管。脑脊液通过第四脑室的开口流到蛛网膜下腔，最终主要通过上矢状静脉窦的蛛网膜颗粒吸收。在临床实践中，不能将CSF收集定义为非侵入性，发生或通过腰穿（LP）将针插入椎管的蛛网膜下腔或直接在手术中进行。然而，尽管LP并非完全没有风险，但如今被认为是相对安全的程序，通常可用于某些PBT（例如CNS淋巴瘤和髓母细胞瘤）的分期和随访。此外，理论上的优势是ct-DNA的一部分由于正常细胞直接或间接将其DNA释放到脑脊液中的相对稀缺，脑脊液中CSF的含量应该高于血浆。三项相关研究清楚地表明，与血液相比，CSF为检测PBT基因改变提供了更大的机会[20,21,24]（表2）

在第一个试点研究中，Pan等人，应用ddPCR或靶向扩增子测序来量化从10例患者中收集的CSF和血浆cf-DNA中的肿瘤特异性热点突变，其中包括7例实体脑肿瘤（五个转移灶和两个PBT：前庭神经鞘瘤和非典型性脑膜瘤），以及三个患有软脑膜疾病的患者。在7例实体脑肿瘤患者中，有6例在CSF中检测到肿瘤突变，而唯一在CSF中没有突变的患者是前庭神经鞘瘤[20]。当全身性疾病负担较低时，CSF中的ct-DNA浓度要高于血浆[20]。此外，使用癌症专家组测序，在一名脑膜炎患者的脑脊液中鉴定出七个体细胞突变，其结果与原发肿瘤组织的基因检测一致。

年，Wang等人研究了35例不同PBT（10个LGG，13个HGG，6个髓母细胞瘤，6个室管膜瘤）和解剖部位（后颅窝14个，幕上8个和13在脊髓）的CSF中存在肿瘤DNA（在本研究中表示为CSF-tDNA）。初次手术时，大多数CSF样品是直接从CNS腔中收集的，然后进行靶向测序，然后用WES鉴定肿瘤组织中的突变，分离出的DNA量差异很大（平均值为ng，标准偏差为ng）。在35个肿瘤样品中至少鉴定出一种突变。使用PCR扩增和测序从匹配的CSF纯化的DNA中，此类突变的检出率为74％（95％CI：57–88％），非常接近在与其他肿瘤类型（例如：尿路上皮癌[22]或肺癌的支气管冲洗[23]。CSF中平均可检测到的突变等位基因分数为12.2％，低于肿瘤组织中的分数，但远远超过了所用测序试验的检测极限（0.01％）。值得注意的是，有18/19例HGG患者的CSF中可检测到t-DNA水平，显着高于LGGs（突变等位基因分数为16.3±21.2％对2.8±6.8％）[21]。值得注意的是，在所有肿瘤中均发现了CSF-t-DNA（13个WHOIII级或IV胶质瘤，五个髓母细胞瘤，三个室管膜瘤；21例病例中有％）与CSF储层或皮层表面邻接，而包入脑组织的肿瘤的CSF中没有ct-DNA（p0.）[21]。在多变量logistic回归分析中，发现与CSF-t-DNA检测有关的临床特征时，只有靠近CSF储库的肿瘤和肿瘤分级才有意义[21]。这些发现表明，侵入CNS腔的HGG细胞释放的DNA可能代表了CSF-t-DNA的主要来源[21]。尽管在本研究中，在初次或重复手术期间从邻近肿瘤的储库中收集了脑脊液，但鉴于通过内部脑室和蛛网膜下腔的脑脊液循环方式，有人建议LP在回收富含ct-DNA的脑脊液方面同样有效[21]。

在同一年，DeMattos-Arruda等人通过靶向靶标（MSK-IMPACT）和/或WES结合ddPCR对NGS进行了分析。同时收集12例PBT或转移性病变（4个GBM，6个乳腺癌的脑转移，2个肺癌的脑转移）患者的CSF和血浆DNA以及肿瘤组织。在所有病例中均检出可检测到的CSFct-DNA水平，而血浆ct-DNA仅存在于大内脏疾病患者中，而在中枢神经系统疾病患者中则没有。与相应的肿瘤组织相比，GBM病例显示CSFct-DNA的基因组改变率最低[24]。总体而言，这些早期研究清楚地表明，CSF是ctDNA的潜在有价值来源，其中广泛的基因组改变，包括假定的可操作的突变和拷贝数变化（CNA）可以高灵敏度检测出来。这些数据为使用CSFct-DNA作为生物标记物提供了方法，无论原发肿瘤组织的可用性如何，均可提供分子诊断，预后和预测信息。此外，微创和可重复的程序（例如LP收集CSF）将提供前所未有的监测机会，例如肿瘤负荷的纵向追踪以及CT和RT复发后肿瘤基因组进化的评估。

5、PBT中CSF的全面和纵向基因组分析，已经对CSFct-DNA的综合表征评估了最新的基因组谱分析技术（表3）。

MemorialSloan-Kettering小组系统地研究了包括个与癌症相关的基因在内的高通量测序分析（MSK-IMPACT）是否能够鉴定通过LP从53名疑似或已知中枢神经系统疾病患者中收集的CSF样本中的ct-DNA[25]。在这些患者中，有12例具有PBT，其余的大脑和软脑膜转移灶[25]。在63％的CNS转移患者中检测到高可信的体细胞突变，但没有CNS参与的患者中没有检测到突变（n=9）[25]。在12例弥漫性神经胶质瘤患者中，收集到的CSF样本中有50％观察到了突变[25]。但是，由于没有使用相同的方法分析匹配的肿瘤标本，因此很难下结论CSFct-DNA是否忠实地反映了遗传原始肿瘤的特征[25]。

在随后的研究中，同一小组进一步对来自不同级别弥漫性神经胶质瘤成年患者（46个GBM，26个WHOIII级和13个WHOII级）的成年患者的85例脑脊液样本采用相同的基于NGS的分析（MSK-IMPACT），进一步描述了神经胶质瘤的遗传学特征[26]。CSF收集是通过LP进行的，作为患者临床管理的一部分，用于提示CNS感染，脑膜扩散或颅内压升高的体征或症状[26]。值得注意的是，CSF收集于初次手术后很长时间，在所有情况下均在辅助肿瘤治疗（RT）之后收集和CT）[26]。多种放射学参数，例如肿瘤进展，肿瘤负荷，脑室内扩散，与脑脊液中的DNA泄漏密切相关[26]。相反，在胶质瘤级别，疾病持续时间或在先治疗方面没有相关性[26]。CSFct-DNA的存在即使在调整诊断时的切除范围，CSF收集的肿瘤负担和IDH突变状态后，也能在多变量分析中建立强大的独立不良预后因素[26]。85名患者中有42名（49.4％）在脑脊液中观察到了肿瘤衍生的遗传改变，最常见的是TERTp，TP53或IDH突变，CDKN2A/CDKN2B缺失，EGFR扩增和EGFRvariantIII缺失[26]。在19例脑脊液ct-DNA阳性的患者中，有16例血浆cf-DNA未检测到突变，再次证实血液不是胶质瘤DNA的可靠来源[26]。首次手术时获得的所有可得的肿瘤标本，均属于CSFct-DNA阳性的患者，包括20个GBM，10个低级神经胶质瘤和6个具有超突变特征的肿瘤，均用相同的基因面板测序[26]。这种基因比较可以研究脑脊液是否显示出遗传进化的肿瘤迹象。30例无超突变特征的病例中，肿瘤与脑脊液共有突变的比例为81.7％，而在这六种超突变的肿瘤中，这种突变的发生率较低（3-49％；中位数为19.6％）[26]。在所分析的所有十例病例中，低级神经胶质瘤的分子诊断特征在脑脊液和组织之间是一致的[26]。

在收集CSF之前，接受TMZ治疗的5例CSFct-DNA样本中观察到明显更高的突变负担以及暗示先暴露于烷化剂的遗传特征（G：C→A：Ttransitions）[26]。有趣的是，随着肿瘤和脑脊液收集之间的间隔增加，脑脊液的遗传特征倾向于与原发肿瘤不同[26]。然而，根据胶质瘤进化的既定模式，肿瘤组织与脑脊液之间的分歧通常不涉及早期的“横断”改变，例如1p/19q共缺失或IDH1，TP53，TERT和ATRX突变，而涉及生长信号通路的变化，如EGFR，PDGFRA，MET等，反映了推测的趋同演化[26]。Moulière等人使用了低深度覆盖范围（0.4x）的无目标，成本相对较低的浅WGS。目的是在无需先天了解肿瘤组织改变的情况下鉴定CSF中的ct-DNA[27]。具体来说，在13例原发性HGG患者的CSF样本中分析了CNA和DNA大小分布[27]。尽管队列规模较小且sWGS的敏感性有限，但在5/13（39％）患者中观察到了CNA[27]。在一种情况下，可以进行代表不同肿瘤区域的多个活检，大多数CNA由CSF和肿瘤组织共享[27]。有趣的是，在CSF中检测到10号染色体的丢失和7号染色体的获得，但在四个肿瘤标本之一中却未检出，这表明CSFct-DNA可能再现了肿瘤的空间异质性[27]。值得注意的是，在这项工作中，首次报道了从WGS数据推断出的CSF碎裂模式分析[27]。在大多数脑脊液样品中观察到了一种特异性的碎片特征，其富集片段小于bp，峰值低至bp，或与血浆和尿液中观察到的峰不同[27]。在这项工作中实施的方法学可能是另一种选择低成本检测脑脊液中神经胶质瘤ct-DNA的方法，能够同时提供重要的基因组信息，并为高水平ct-DNA的患者提供更昂贵的大规模测序的前提[27]。

影响成功检测肿瘤遗传改变的重要变量是在LP回收的CSF中发现的质量（片段化与高分子量）和DNA数量。迄今为止发表的研究尚未对这些参数或它们与有关肿瘤体积和定位的数据的关系进行系统的表征。Pentsova等。[24]报道在CSF上清液（通过细胞离心清除）中，平均DNA为27ng（N=8）。但是，正如Moulière[26]所示，不同样本之间的高变异性是可以预期的。当前基于PCR或NGS的技术的敏感性将允许提供少于20ngDNA的信息。

6、着眼于特定的诊断和预后生物标记物

考虑到TERTp和IDH突变具有众所周知的预测生存能力，Juratli等人进行了一项前瞻性研究，评估了在手术期间收集的CSF和血清ct-DNA中检测这些热点突变的可行性。包括60名患有不同神经胶质瘤亚型的患者[28]。为了减少潜在的混杂因素，仅选择TERTpmutant/IDHWTGBM（n=38）的患者进行分析，并通过巢式和ddPCR研究[28]。值得注意的是，在CSF样品中检出TERTp突变的敏感性为92％（35/38例），远高于血浆ct-DNA的突变（3/38；敏感性为8％）[28]。Alltumor接近CSF储库，而唯一完全位于脑实质的肿瘤在CSF中未显示TERTp突变[28]。与高VAF患者相比，CSF-tDNA中TERTp低等位基因频率（VAF）低的患者的总生存期明显更长[28]。阈值为13％的TERTp突变VAF代表整体生存的独立阴性预后因素[28]。在少部分神经胶质瘤（TERTp-mutant/IDHmutant）中观察到脑脊液中TERTpmutation检测的敏感性较低，这与以前的发现一致，即低度肿瘤可能仅在脑脊液中脱落少量的肿瘤DNA[18,28]。

在弥散中线神经胶质瘤的情况下，基于脑脊液的液体活检策略的临床价值可能很高。这些肿瘤确实是丘脑或脑干的高度病态的神经胶质瘤，几乎仅在幼儿中出现，通常不能通过手术获得，其特征是功能获得率较高的组蛋白H3突变率很高。Haung等。研究人员从儿童的治疗过程中收集了12份CSF样本，根据CSFDNA的水平，通过传统的靶向Sanger测序或巢式PCR来搜索H3F3A和HIST1H3B突变[29]。CSF-DNA量从0.01到3.76ng/lL不等[29]。在这个小队列中，H3突变的特异性为％，敏感性为87.5％，证明了脑脊液液体活检法可用于分子诊断和选择分子靶向疗法的可行性[29]。

Martinez-Ricarte等。开发了一个测序平台，可同时检测一组基因突变（IDH1，IDH2，TP53，ATRX，TERT，H3F3A和HIST1H3B），这些突变对于定义分子胶质瘤亚组至关重要[5,30]。通过靶向外显子组测序和ddPCR分析了20例脑胶质瘤患者的肿瘤标本和CSFct-DNA[30]。脑脊液DNA浓度从3.6到.7ng/mL不等，从枕大池收集到的单个值为ng/mL[30]。在20例病例中，有17例在CSF中发现了ct-DNA，其突变特征与匹配的肿瘤样本相同，因此可以进行正确的诊断[30]。脑脊液中缺少ctDNA的3例病例均为LGG（1级II级弥漫性星形细胞瘤和2级II级少突胶质细胞瘤），再次提示肿瘤分级可能是影响CSF中ct-DNA存在的关键因素[30]。作为高度相关的发现，该队列中的所有三个中线神经胶质瘤均显示出CSFct-DNA中特征性的H3K27突变[30。

表4总结了这些针对特定神经胶质瘤生物标志物的研究数据[28-30]。

7、问题和争议

在过去的几年中，我们对弥漫性胶质瘤的遗传和表观遗传学知识的了解大大增加了。现在，定义神经胶质瘤亚型的关键基因组改变已成为常规诊断工作的一部分，可以对患者的预后进行分层，并指导治疗决策[4-10]。目前，弥散性神经胶质瘤的分子表征仍需要获得肿瘤标本。毫无疑问，使用ct-DNA作为胶质瘤基因组学表征的可靠生物标志物的想法可以避免冒险的手术操作。基于ct-DNA的液体活检对神经胶质瘤患者管理的不同领域具有潜在的重大影响。ct-DNA的分析可在所有解剖位置或患者合并症使手术具有挑战性或根本不可行，且常规采样方法无法解决的所有情况下促进诊断内容丰富。而且，ct-DNA可以提供整个肿瘤基因组的全面框架，从而有可能概括宽广的时空肿瘤内异质性，这是公认的弥漫性神经胶质瘤的标志。除诊断目的外，ct-DNA测序还应针对纵向监测基因组进化，以期在抗癌治疗后复发或进展时提供新的分子特征，这通常是由于无法获得连续的活检样本所致。神经病学领域中最近出现的多种新型分子靶向和免疫治疗剂也为患者的分子谱分析和治疗选择提供了改进的工具，尤其是在复发时，如果基因组特征可能与原发性不同。液体活检在监测肿瘤负荷和对肿瘤治疗的反应中也起着关键作用。事实上，目前基于MRI的神经成像准确性有限，常常缺乏掩盖CNS肿瘤典型现象的两种能力，如伪进展和伪反应[31]。Anovel工具可帮助医生评估神经胶质瘤的临床行为，区分假进展和真实进展，或甚至在放射学证据之前确定早期复发，将具有很大的临床实用性.

目前在脑肿瘤领域中使用ct-DNA的数据来自一小批患者，常常包括不同的PBT或转移性病变[13-30]。此外，可用的研究之间的脑脊液采样方法和时间差异很大，适用于脑脊液ct-DNA分析的检测和测序方法也不同。从翻译的角度来看，已经确定了一些重要的结论，但是仍然存在一些问题。首先，在神经胶质瘤的背景下，ct-DNA的最佳来源是脑脊液。多数神经胶质瘤在脑脊液中脱落了ct-DNA[20,21,24-30]，而血液ct-DNA的水平很低并且仅在少数患者中可以检测到，这可能是由于BBB的存在[13-19]。其次，脑脊液ct-DNA液体活检可能对所有神经胶质瘤亚型的诊断均无效。鉴于它们的生长分数速率慢和细胞性差，只有极少数的LGG将可检测量的ct-DNA释放到CSF中，从而排除了它们的分子谱分析[20,21,24-30]。即使包封在脑实质内的脑胶质瘤且不直接邻近脑脊液储库或皮层表面，其检出率似乎也较低[21]。第三，CSFct-DNA提供了相应肿瘤基因组的全面且遗传上忠实的代表[20,21,24-30]。CSF和肿瘤DNA总体上的基因一致性水平似乎很高，尤其是在同时接受CSF收集和肿瘤切除的患者中[24,26]。反映神经胶质瘤的遗传进化，在手术后很长的时间收集脑脊液会观察到一定程度的差异[24,26]。在这些情况下，分子差异不涉及在胶质瘤形成过程中早期发生的遗传改变，例如IDH1、1p/19q共缺失，TP53，TERT，ATRX，而是编码前生长因子信号通路的基因[24,26]。

在不久的将来要解决的问题主要涉及脑脊液样本采集的方法和时间，以及要应用的扩增和测序技术（靶向方法与非靶向方法）。如果我们的意图超出了诊断范围，而是要追踪动态基因组进化或追踪肿瘤反应，则必须重复进行连续CSF采样。在这方面，尽管存在侵入性，潜在风险以及禁忌炎的整个临床情况，但LPremains仍然是唯一可以在治疗过程中收集和分析CSFct-DNA的程序。

最佳检测方法的选择主要取决于要追求的目标，应仔细考虑复杂度，速度和成本之间的准确平衡。展望常规临床环境中的未来实现，一种相对低成本的基于PCR的靶向方法可评估已知热点突变和扩增的一小部分候选基因，具有高水平的分析灵敏度（检测水平在0.-0.01％之间）和特异性似乎是最合理的策略。尽管由于低复用能力而受到限制，基于ddPCR的方法仍可以为临床医生提供分类不同神经胶质瘤亚型，定义患者预后和指导治疗所必需的全部分子信息。NGS技术具有巨大的潜力，不仅可以揭示突变，而且可以揭示与癌症相关的所有类型的变异，包括基因融合。开发预定义的测序平台以同时并有效地询问多个基因座，包括编码治疗干预潜在靶标的基因，将具有更大的临床实用性。在没有肿瘤分子畸变先验知识的情况下，更广泛的无靶ct-DNA全基因组测序应有助于发现新的可操作突变或从头获得性耐药突变。这些技术是昂贵的，需要生物信息学专业知识和更长的时间来处理和分析结果。如今，这种方法应限于研究目的。从这篇评论中可以清楚地看出，这些创新生物标志物的理想用途尚待确定，只有较大的前瞻性研究专门针对神经胶质瘤患者，并已整合到治疗性临床试验中，才能提供明确的答案，并最终为将CSFctDNA分析引入临床提供所需的证据水平实践。CSF收集的技术标准化和CSFct-DNA提取方法的验证是朝着这个方向迈出的关键步骤。