B7-2(CD86)协调刺激因子在急性实验性变态反应性脑脊髓炎（AEAE）发挥主导作用

中国神经免疫学和神经病学杂志 2000年第3期第7卷 多发性硬化专题

作者：耿同超

单位：耿同超（中日友好医院神经科，北京 100029）

　　关键词: 多发性硬化；实验性变态反应性脑脊髓炎；协调刺激分子B7-1；B7-2

　　摘要: 目的　探讨协调刺激分子B7-1（CD80）和B7-2 (CD86) 在急性EAE发病过程中的作用。方法　观察抗B7-1 和B7-2 抗体在体外对淋巴细胞抗原特异性增殖反应和细胞因子分泌的抑制作用和在体内对EAE发生过程的影响。结果　抗B7-2抗体抑制PLP136-150抗原引起的特异性细胞增殖和IL-2产生，抗B7-2抗体处理过的淋巴母细胞诱导轻症被动EAE；在主动EAE诱导的早期抗B7-2抗体虽能延缓发病时间但加重病情，可能与IL-4分泌不足有关；当临床EAE首发症状出现时，抗B7-2抗体减轻其临床表现。结论　协调刺激分子B7-2 在AEAE发生过程中发挥重要作用。

　　中图分类号： R744.5　文献标识码： A

　　文章编号：1006-2963 （2000）03-167-05

Costimulatory Molecule B7-2（CD86）Plays a Dominant Role

　　in Acute Experimental Allergic Encephalomyelitis (AEAE)

GENG Tong-chao

　　(Department of Neurology, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029，China)

　　ABSTRACT： Objective　To investigate the dominant roles of costimulatory molecules(B7-1, CD80; B7-2,CD86) in AEAE. Methods　Antibodies of anti-B7-1 and B7-2 were used to check the proliferation and cytokines production of T cells specific to PLP 136-150 in vitro, and the effects on the active AEAE in vivo. Results　Anti-B7-2 mAb inhibited the proliferation of cells and the production of IL-2，resulted in diminution of clinical illness with in vitro activated PLP specific-T cells; delayed but enhanced the clinical manifestation of EAE and lowered the production of IL-4 when administered at the initial stage of EAE；ameliorated the clinical score as EAE first sign seen. Conclusion　Costimulatory molecule B7-2 plays an important role in the induction of AEAE.

　　Key words： multiple sclerosis; acute experimental allergic encephalomyelitis; costimulatory molecules

　　抗原递呈细胞（antigen presenting cell， APC）表面上的B7-1和B7-2分子与T淋巴细胞表面上的CD28或CTLA4分子相结合提供协调刺激信号，激活T细胞，形成克隆扩增，分泌细胞因子以发挥免疫功能^［1］。如果封闭B7-1 和B7-2分子则细胞呈现无反应状态,由此为自身免疫性疾病的治疗留下可想象空间，并得到动物体内实验证实^［2，3］。研究发现B7-1和B7-2可能对细胞传递不同的信号以影响其免疫活性。但在实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）及其他动物模型的研究中有关两个B7分子所发挥作用的结论并不一致^［3-5］。本实验研究目的就是通过观察抗B-7抗体对体外培养淋巴细胞，以及在急性主动和被动EAE发生过程中的可能作用，进一步了解两个协调刺激分子所发挥的不同作用。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　SJL/J雌性小白鼠购于美国Jackson实验室，饲养在日本国立神经研究所动物中心。使用时7～10周龄。PLP136-150抗原为本所实验室人工合成。单克隆抗体B7-1、B7-2抗体，同型对照抗体IgG2a、IgG2b，捕获和生物素标记的抗白介素2、4（IL-2、IL-4）、干扰素（IFN-γ）抗体及重组细胞因子标准样品等全部购于PHARMINGEN公司。

　　1.2　方法

　　（1）在本实验中，免疫动物的PLP136-150抗原剂量均为200 μg/只，每组动物总数均为15只。淋巴细胞特异性抗原增殖反应检测方法见参考文献［6］。不同的是： 1）为观察B7抗体在体外对细胞增生的影响，在加入抗原（20 μg/mL）的同时再分别加入抗B7以及对照抗体（浓度均为10 μg/mL），并在第24、48 h收取培养上清液分别用来检测IL-2 、IFN-γ和 IL-4等细胞因子。2）为观察抗B7抗体在体内对免疫活性细胞的作用，在抗原免疫动物的第0、第2和第4 d分别或联合腹腔注射抗B7抗体或对照抗体。于免疫后第7 d采取引流淋巴结，分离细胞检测其特异性反应及细胞因子的分泌。细胞因子检测方法见参考文献［7］。

　　(2) 被动EAE的诱导方法见参考文献^［6］。不同的是，在加入PLP136-150特异性抗原（20 μg/mL）培养形成免疫活性淋巴母细胞的同时，分别加入抗B7和对照抗体，其浓度均为10 μg/mL。

　　(3) 抗B7抗体对主动EAE的治疗方面，不同组别小鼠在用PLP136-150诱导EAE的1）第0（当天）、第2和第4 d；2）第7、第9和第11 d，分别或联合经腹腔注射抗B7-1、抗B7-2、抗B7-1和抗B7-2，相匹配对照抗体IgG 2a、IgG 2b、IgG 2a和IgG 2b共3次，每次200 μg/鼠，联合注射组每种抗体各100 μg/鼠。EAE临床观察记分方法见参考文献^［6］。

　　2　结果

　　1.抗B7-2抗体抑制PLP136-150特异性抗原引起的细胞增殖和IL-2产生，经抗B7-2抗体处理的淋巴母细胞引起临床轻度EAE表现。如图1所示，抗B7-2抗体不仅抑制特异性抗原所引起的增殖反应（图1a），显著降低IL-2的生成（图1b），而且接受抗B7-2抗体处理过的淋巴母细胞的小鼠，临床表现轻度EAE（图1c）。相对于抗B7-2抗体，抗B7-1抗体几乎不干扰淋巴细胞的特异性增殖，也不干扰IL-2的生成，接受抗B7-1抗体处理过淋巴母细胞的小鼠，临床则表现为重度EAE，与对照组相比并无明显区别。此外，与单用抗B7-2抗体相比，联合使用抗B7-1 和B7-2 抗体抑制细胞增殖反应较明显，但对IL-2分泌的抑制作用，两者并无区别（图1a和1b）。抗B7-1抗体不抑制干扰素的分泌，而抗B7-2抗体则对其具有抑制作用，联合组的抑制作用最强（资料未给出）。

图1(a)　抗B7(2)抗体抑制脂蛋白

　　136-150特异性细胞增生

　　Fig 1(a)　AntiB7(2) inhibited the prohferation

　　of cells specific to PLP 136-150

图1(b)　抗B7(2)抗体抑制脂蛋白136-

　　150特异性细胞白介素2产生

　　Fig 1(b)　AntiB7(2) inhibited the production of IL-2

图1(c)　抗B7(2)抗体处理后的脂蛋白136-

　　150特异性细胞引起中度被动EAE

　　Fig 1(c)　AntiB7(2) resulted in moderate passive

　　EAE after treatment in vitro activation

图2(a)　在诱导主动EAE同时注射抗B7(2)

　　抗体延迟但加重主动EAE临床表现

　　Fig 2(a)　AntiB7(2) delayed but enhanced the

　　clinical manifestation of active EAE

　　2.为了观察抗B7抗体在体内的作用，在诱发主动EAE的不同时段，对实验小鼠分别或联合腹腔注射抗B7及对照抗体。结果如图2a所示。如果在诱导EAE的初始注射抗B7-2抗体，虽可延迟但加重EAE的临床表现，这种现象在联合注射抗B7-1和B7-2抗体时更为突出。 体外实验发现细胞因子IL-4分泌不足(图2b)。与对照组相比各组均增加IL-2的分泌，其中联合抗体组最强，次为抗B7-1组，再为抗B7-2组，对干扰素的分泌作用各组间均无区别（资料未给出）。若首发症状（小鼠变懒）出现时，注射抗B7-2抗体可延缓并减轻EAE的其他临床症状（注射联合抗体组最明显），而注射抗B7-1抗体组小鼠EAE的临床表现与其他对照组相仿（图2c）。

图2(b)　体内注射抗B7(2)抗体降低白介素4产生

　　Fig 2(b)　AntiB7(2) lowed the production of IL-4

图2(c)　当EAE首发体征出现时注射抗B7(2)抗体减轻其临床症状

　　Fig 2(c)　AntiB7(2) ameliorated the clinical score of EAE

　　3　讨论

　　多发性硬化(MS)的发病原因和机制并不清楚，但公认由Th1介导的细胞免疫机制参与其发病。Kuchroo等人借助MS的动物模型EAE研究发现，用抗B7-1抗体治疗能减轻患病动物的临床症状严重程度，机制是抗B7-1抗体封闭B7-1分子后使Th1型淋巴细胞转变成Th2型细胞，分泌免疫功能抑制性细胞因子如IL-4。相反，抗B7-2抗体则加重EAE临床表现程度，并对慢性复发性EAE无效。因而认为B7-1分子在EAE的发病过程中发挥重要作用^［3］。Vanderlugt等人的实验结果则与此完全相反，在缓解期注射抗B7-1抗体，加重慢性复发性EAE的临床表现,并伴随急性中枢神经系统的损害，诱导产生对内源性髓鞘蛋白具有特异性反应的T细胞（epitope spreading）^［8］。胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）也被认为是一种免疫性疾病，自身反应性Th1细胞在疾病发生和进展中起着主要作用。在其动物模型的实验中Lenschow等发现，如果在疾病的早期用抗B7-2抗体处理动物可抑制糖尿病的发生，而抗B7-1抗体则加速疾病的发生、进展，并可使原本抵抗疾病发生的动物也发病^［4］。Nuriya等人在一由Th1细胞介导的皮肤病动物模型中发现，在疾病诱导的早期如果用抗B7-2抗体处理动物，可以抑制疾病的临床症状，减轻组织学上的水肿和炎性细胞浸润，而抗B7-1抗体则无此作用^［5］。特别是我们的体外实验结果更支持B7-2分子在免疫活性细胞诱导早期的重要作用。我们认为产生不同结果的部分原因可能与动物的种类、抗原剂量的大小以及抗体处理的次数和剂量等多方面因素有关，当然这有待于进一步研究证实。同时封闭B7-1和B7-2分子加重EAE临床表现已被多人所注意^{［3，4，9］}，但解释不同。若在诱导EAE的初始注射抗B7-2或联合注射抗B7-1和B7-2抗体，虽可延迟但加重 EAE的临床表现，我们的结果提示这或许与具有免疫抑制作用的IL-4分泌不足有关。有人解释为协调刺激分子CD28在自身免疫性疾病发生的不同时期作用可能有别，或许存在其他协调刺激分子^［4］，有人发现这是免疫增强因子IL-2等过剩分泌的结果^［9］。当EAE首发症状出现时，实施抗B7-2抗体抑制EAE的临床表现提示B7-2协调刺激分子既可影响免疫活性细胞诱导的早期阶段^［5］，也可作用其效应阶段^［4］。本实验结果表明，协调刺激分子B7-1和B7-2在急性EAE的发生过程中具有不同的生物学活性，其中B7-2发挥主导作用，并且在不同的疾病阶段协调刺激分子B7-2的作用可能有别。

　　总之，由CD28所介导的协调刺激通路多方位参与机体的免疫反应。利用不同条件干扰这一通路可能会给人类治疗自身免疫性疾病带来机会。然而，不同种类的生物体以及不同的疾病模型所产生的不同临床表现，甚至同种动物所诱导的同种疾病模型得到相反的实验资料，以及体内和体外实验结果的不一致性提醒人们生物体内CD28/B7协调刺激系统极具复杂性，若将其有效地用于治疗人类由T细胞介导的自身免疫性疾病任重而道远。

　　作者简介：耿同超（1956-），男，河南省人，硕士，副主任医师。1992～1993年、1995～1997年分别赴日本国立神经研究所研修。主要从事神经免疫学研究。通讯地址：中日友好医院神经科，北京 100029。联系电话：（010）64221122-3233。

　　参考文献：

　　［1］　June CH, Bluestone JA, Nadler LM,et al. The B7 and CD28 receptor families ［J］. Immunol Today , 1994,15(7)：321-331.

　　［2］　Schwartz RA. Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in IL-2 production and immunotherapy ［J］. Cell, 1992,71：1065-1068.

　　［3］　Kuchroo VK, Mercy Prabhu Das, Brown JA,et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy ［J］. Cell, 1995,80：707-718.

　　［4］　Lenschow DJ, Ho SC, Husain S, et al. Differential effects of anti-B7-1 and anti-B7-2 monoclonal antibody treatment on the development of diabetes in the nonobese diabetic mouse ［J］. J Exp Med, 1995,181：1145-1155.

　　［5］　Nuriya S, Yagita H, Okumura K, et al. The differential role of CD86 and CD80 co-stimulatory molecules in the induction and the effect phases of contact hypersensitivity ［J］. Int Immunol, 1996, 8(6)：917-926 .

　　［6］　耿同超，山村隆，田平武. 脂蛋白对实验变态反应性脑脊髓炎的阻断研究［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志， 1994，1（1）：14-18.

　　［7］　耿同超. 脂蛋白136-150（PLP 136-150）和它的变异抗原与实验变态反应性脑脊髓炎［J］（待发表）.

　　［8］　Vanderlugt CL, Karandikar NJ, Lenschow DJ, et al. Treatment with intact anti-B7-1 mAb during disease remission enhances epitope spreading and exacerbates relapses in R-EAE ［J］. J Neuroimmunol, 1997,79：113-118.

　　［9］　Perrin PJ, Maldonado JH, Davis TA, et al. CTLA-4 blockade enhances clinical disease and cytokine production during experimental allergic encephalomyelitis ［J］. J Immunol, 1996,157：1333-1336.

收稿日期：2000-03-01； 修订日期：2000-05-16