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鲍 健 胡学强 2005-12-13 13:01:43 中华实用医药杂志 2004年9月第4卷第18期 【摘要】 目的 建立昆明鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，为研究多发性硬化的免疫病理机制及实验性治疗的研究提供实验依据。方法 用不同剂量同源脊髓匀浆皮下注射致敏昆明鼠制作模型，观察比较不同剂量诱导发病的临床表现及病理结果。结果 各组小鼠均有一定程度的发病，病理有血管周围细胞浸润和脱髓鞘表现。结论 用同源脊髓匀浆加福氏佐剂间隔1周2次皮下注射可以成功诱导昆明鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎，在0.5～100mg的剂量水平之间，病情与诱导免疫剂量不存在线性关系。
关键词 实验性自身免疫性脑脊髓炎 昆明鼠 动物模型
Bao Jian，Hu Xueqiang
Key words experimental autoimmune encephalomyelitis Kunming mice animal model
实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是用同种或异种中枢神经系统白质抗原或抗原特异性T淋巴细胞诱导敏感动物发生的主要累及中枢神经系统髓鞘的自身免疫性炎症，其临床表现及病理变化和多发性硬化（multiple sclerosis，MS）极其相似，是目前研究MS常用的动物模型。皮下多部位注射致敏原可以诱导多种动物（包括猕猴、豚鼠、大鼠、小鼠）发生EAE ［1］ 。不同物种的模型在临床表现和病理变化等方面各有一定的特点，在MS研究中各有其应用价值。
小鼠的遗传背景资料详尽 ［2］ ;实验材料丰富，花费少;小鼠EAE模型多表现为缓解-复发病程，并且其生命周期短，有利于复发性慢性疾病的观察研究，所以有关小鼠EAE模型的研究数量较多 ［3～7］ 。不同的鼠种对于EAE诱导的易感性有一定差别，抗原的种类和剂量等因素对诱导的成功率有一定影响。本实验通过将不同剂量同源脊髓匀浆致敏原注射于小鼠皮下部位，利用EAE临床分级、病理学检查方法观察不同免疫剂量差异对实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 本实验采用的清洁级昆明鼠40只，雌性，6～8周龄，饲养条件为清洁级，5～10只/笼，任意供水。实验期间3级以上瘫痪和濒危鼠予以单笼饲养，鼠粮用饲水浸软后喂给，每日人工喂水2次。实验动物用完全随机法分组。
1.2 方法
1.2.1 EAE模型制备 新鲜昆明鼠脊髓，加生理盐水制成同源脊髓匀浆，再加完全福氏佐剂配成油包水剂，多部位腹侧皮下注射，0.2ml/鼠。1周后用抗原加不完全福氏佐剂加强免疫1次。
昆明鼠随机分为6组，每组分别用100mg、50mg、10mg、5mg、1mg和0.5mg同源脊髓皮下注射，首次免疫同时及之后48h给予穿孔素（pertussis toxin，PT）腹腔注射，每只昆明鼠每次用量为200μg，溶于0.2ml磷酸盐缓冲液中。
1.2.2 EAE症状分级 参照国内外常用方法 ［7，8］ ，按6级计分:正常，0分;鼠尾张力障碍，1分;部分后肢瘫痪或步态不稳，2分;完全后肢瘫痪，3分;部分或完全前肢瘫痪，4分;濒死状态或死亡，5分。死亡鼠在发现死亡当日记为5分，次日起不再计分。
恢复期判断标准为起病5～10日后临床计分降为2分或以下。复发判断标准为临床计分升高至少1分（伴较明显或突然的体重下降） ［9，10］ 。
1.2.3 病理学方法 随选取不同病程昆明鼠，将头颅与脊柱一起分离，放入10%中性福尔马林中固定24～48h，再分出脑和脊髓组织，切成0.5cm厚的组织块，按常规方法脱水、透明、浸润、包埋、制成蜡块。切成4μm，分别作HE染色、轴突染色（改良Bielschowsky法）、髓鞘染色（Page氏搔络铬花青染色法）。1.2.4 统计学处理 实验数据采用社会科学统计软件包SPSS8.0for Windows进行处理。由于根据经验起病日期不呈正态分布，故先作平方根处理。各变量用X±s描述，对平均最大计分、每日平均计分和起病日期的平方根作组与组间的独立样本t检验。作散点图观察处理剂是与效应之间的关系，再作线性回归分析，并对相应的系统进行检验。P值取为0.05。
2 结果
2.1 病情变化
本实验收集到有效资料的昆明鼠共39只，其中27只（约69%）在从首次诱导算起2周内出现肌力障碍;9只（约23%）在整个观察期中从未出现症状;3只（约8%）在1个月后出现轻微的肌力障碍，起病日期分别为第32、39和43日。39只昆明鼠中有10只在首次发病的急性期死亡，1只在复发期死亡。各组小鼠发病的基本情况见表1。
在接受处理的各组小鼠中，0.5mg诱导组和5mg诱导组发病比率较低，均为50%（3/6），病情也较轻，仅5mg诱导组的22号鼠病程中出现部分性后肢瘫痪，其余均表现为鼠尾张力下降，没有致死鼠。而1mg诱导组、10mg诱导组、50mg诱导组和100mg诱导组的发病比率均达80%以上（分别为6/7、7/8、6/6和5/6），其中50mg诱导组达100%;这4组的致死比率分别为57%、25%、50%和33%（4/7、2/8、3/6和2/6）。急性期致死的小鼠病情恶化急骤，多在出现轻微肌力障碍2天内突然死亡，而50mg诱导组的13号鼠表现有一个从鼠尾张力减低到濒死状态的较明显的进展过程，同组的31号鼠出现肌力障碍后第10天死前肌力障碍曾一度略有减轻。
表1 EAE诱导实验病情一览表（略）组 注:各组的平均最大计分为组内个体小鼠病程中最高计分的均数;每日平均计分为各个个体小鼠病程中的临床计分总和除以该鼠病程天数。急性期过后幸存的小鼠接近一半有不同程度的复发，各组出现肌力障碍的小鼠的平均复发次数在0.4次到1.3次之间。复发次数最多者达5次。复发期表现多较轻微，除15号鼠在复发期死亡外，其它多以鼠尾张力降低和部分性后肢瘫痪为主。
2.2 诱导剂量与病情的关系
我们用独立样本t检验分析本实验中各组间平均最大计分、每日平均计分和起病日期的平方根的差别。结果在P=0.05的水平上，平均最大计分间差异有显著性的有1mg诱导组与0.5mg诱导组（P=0.024）、1mg诱导组与5mg诱导组（P=0.032）、50mg诱导组与0.5mg诱导组（P=0.037）和50mg诱导组与5mg诱导组 （P=0.048）;每日平均计分间差异有显著性，有1mg诱导组与0.5mg诱导组（P=0.036）及1mg诱导组与5mg诱导组）P=0.034）。各组的起病日期的平方根在P=0.05的水平上未发现差异有显著性。
为了明确诱导免疫剂量与病情轻重之间是否存在某种关联，分别做平均最大计分和每日平均计分相对于免疫剂量散点图（见图1、2）并试行回归分析，其分布缺乏明显的倾向性。根据以上结果，我们推论本实验中所用剂量诱导发生EAE无明显差异。
图1 KM鼠EAE最大计分与免疫剂量的关系，剂量单位为mg
图2 昆明鼠EAE每日平均计分与免疫剂量的关系，剂量单位为mg
2.3 病理结果
镜检发现的病灶多在脊髓、脑干和小脑。HE染色切片上可见淋巴细胞和单核细胞围绕小血管周围呈袖套样浸润。髓鞘染色切片上可以见到小块脱髓鞘病灶散在分布于小血管附近。轴突染色切片上病变轴突粗细不均、扭曲断裂，着色深浅不一。所见病理改变与文献报道基本相同。
3 讨论
为了研究MS的发病机制，人们通常采用EAE、慢性病毒脱髓鞘疾病、毒素介导的有齿动物脱髓鞘等几种动物模型:其中EAE的髓鞘损害是由免疫反应介导的、对髓鞘或少突胶质细胞上的自身或外来抗原直接攻击所致，故与人类中枢性脱髓鞘疾病多发性硬化极为相似，因而成为多发性硬化的发病机制、病理及临床研究的最佳选择。
早在1933年，Rivers等 ［11］ 就开始通过注射神经组织抗原制作EAE模型。以后，逐渐引进加用福氏佐剂和穿孔素等方法以易化诱导过程。对于不同的物种，敏感抗原的种类、剂量和免疫过程有一定的差别。Brown等 ［3］ 用同源脊髓匀浆和结核杆菌合用诱导SJL/J小鼠EAE，发现该鼠种对诱导非常敏感。用低至0.025mg的同源脊髓匀浆和0.03mg结核杆菌与IFA皮下注射即可成功诱导发生EAE。
本实验采用同源脊髓匀浆作为自身抗原和福氏佐剂合用，成功诱导制作昆明鼠EAE模型，致敏后20d内出现典型EAE表现，组织病理学检查证实可见大量炎性细胞浸润，髓鞘脱失、轴突损害明显，均符合EAE的病理改变特点。表明该模型的建立方法可靠，成功率较高。不同免疫剂量的差异对EAE临床病情的改变不存在线性关系。
与以往报道相比，本实验的发病比率稍低，总体为69%，1mg诱导组为86%。原因可能在于鼠种差别和所用的结核杆菌的种类和剂量不同。另外，本实验的致死比率较高，急性期死亡者病情恶化迅速，除了鼠种差别外，可能还同我们在实验中加用穿孔素有关。本实验中0.5mg诱导组和5mg诱导组的临床病情较轻，发病比率也较低，但是综合考虑最大计分、每日平均计分和起病日期等其它指标，尚不能认为这是免疫剂量差别所造成的结果，同时统计学分析没有发现免疫剂量与病情之间存在关联。因此，我们考虑这些表现可能与昆明鼠是远交系小鼠，个体的免疫反应特点变异性较大有关。
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