疾病治疗_脑脊液漏

实验性变态反应性脑脊髓炎与细胞凋亡

中国神经免疫学和神经病学杂志 2000年第3期第7卷多发性硬化专题

作者：王惠　林嘉友　杨天祝

单位：中国医学科学院基础医学研究所免疫学研究室，北京 100005

　　关键词: 实验性变态反应性脑脊髓炎；细胞凋亡

　　摘要：实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是研究人类多发性硬化(MS)的经典动物模型，EAE发病和愈复过程中细胞凋亡的情况也是目前神经生物学的研究热点。研究者们发现，EAE时CNS 损伤区有自身反应性T淋巴细胞的凋亡，而且这种细胞凋亡促进了EAE的愈复和耐受状态的形成，这就为EAE乃至人类MS的防治提供了一条新思路。有关EAE其他细胞凋亡和影响细胞凋亡的因素也有一些研究。本综述对近年来这些方面的研究进展做了较为全面的回顾。

　　中图分类号:R744.5^＋1；R329.2　文献标识码： A

　　文章编号： 1006-2963 （2000）03-175-05

　　实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是T细胞介导的中枢神经系统（central nervous system, CNS）脱髓鞘疾病，是人类脱髓鞘疾病 ——多发性硬化（multiple sclerosis, MS）的经典动物模型。研究EAE的发病及愈复机制，对于MS的预防和治疗都有重要意义。有关EAE发病机制的研究近年来有以下进展：（1）介导EAE发病的淋巴细胞更具体地归类为CD4⁺Vβ 8.2⁺T细胞；（2）淋巴细胞产生的细胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、TNF、IFN-γ、TGF-β等，直接参与炎症反应或反应的修复；（ 3）NO参与EAE的发病，但不同的研究者用不同的动物和诱导方式以及不同的NOS拮抗剂，得出不同结果^［1，2］，因而NO的作用有待进一步明确；（4）Fas/Fas-L系统促进少突胶质细胞的损伤，参与EAE的发病^［3-6］；（5）细胞凋亡(apoptosis)与EAE发病有关，尤其在EAE的愈复和免疫耐受形成中起重要作用。

　　细胞凋亡与免疫系统的关系极为密切，淋巴细胞的凋亡涉及到自身免疫性疾病的康复及耐受机制的形成。对于EAE也不例外。

　　早在60年代中期，就有人发现EAE病程中有细胞死亡，并认为是少突胶质细胞、单核细胞和淋巴细胞死亡。随着凋亡概念的出现和检测技术的发展，Pender等从形态学上证实EAE中的细胞死亡以凋亡的形式出现，并认为其中有少突胶质细胞，而后又发现更多的凋亡细胞是T 淋巴细胞，还有一些为巨噬细胞^［7］。这些研究成果激起学者们的浓厚兴趣，促进了对此问题的深入探讨。

　　目前，对凋亡淋巴细胞的进一步分类、影响凋亡的因素以及凋亡的意义等，都有了很多新的发现。

　　1　EAE中凋亡的细胞

　　1.1　少突胶质细胞　Pender等在证实EAE病程中有细胞凋亡存在的同时发现：凋亡细胞出现在CNS的灰质和白质中；白质中的凋亡细胞与正常的有髓纤维毗邻，慢性EAE中则与脱髓鞘的纤维毗邻；灰质中的凋亡细胞与神经元胞体和髓鞘毗邻；在含有髓鞘碎片、毗邻脱髓鞘轴突的巨噬细胞中有凋亡的细胞体。前人也曾注意到，Cuprizone中毒小鼠CNS中正在死亡的少突胶质细胞有明显的染色质边集和核分裂，形成几个大的致密团块。于是，根据凋亡细胞的大小和位置，Pender等推测凋亡的细胞为少突胶质细胞。但是，对于这种细胞的定性，却没有更具说服力的证据。曾有人提出不同观点，认为EAE时少突胶质细胞不是凋亡，而是细胞溶解。用TUNEL技术检测EAE的凋亡细胞，也未检测到呈阳性反应的少突胶质细胞，从而否定了少突胶质细胞的凋亡^［8］。

　　1.2　淋巴细胞　Pender等虽然没有为少突胶质细胞的凋亡提供更多的证据，但在提出“EAE 的CNS中可能有特异性淋巴细胞的凋亡”后又进行了一系列的研究。1992年他们使用包埋前免疫标记技术发现，CNS中10%CD4⁺细胞和5%αβ T淋巴细胞发生凋亡。而凋亡细胞中， 51%被OX-34标记，38%被R73标记。由此得出结论：急性MBP诱导的EAE,脊髓中的凋亡细胞至少一半以上是T淋巴细胞，并很有可能是自身反应性的、MBP激活的特异性T淋巴细胞(即MBP -特异性T细胞)。其他研究者也发现，脑损伤区的凋亡细胞64%为T淋巴细胞。1994年他们在被动转移的EAE模型用流式细胞仪分析细胞表型和DNA，证实了自身反应性T细胞的凋亡^［9］。该研究发现，Vβ 8.2⁺T细胞在凋亡细胞中的比例是其在正常T淋巴细胞群中的 7倍，显示出凋亡细胞中Vβ 8.2⁺细胞的高度聚集，得出“自身反应性Vβ 8.2⁺T细胞以凋亡的方式从靶器官中选择性消除”的结论。在主动诱导的EAE也得到类似的结果^{［1 0］}。1995年他们使用有限稀释法分析发现，被动转移的EAE在发病高峰期脊髓中MBP-特异性淋巴细胞，即Vβ 8.2⁺T细胞达最高比例（1146个细胞中有1个）；到恢复期，其比例则奇迹般地降至每10⁵个细胞中1个；同时检测的卵白蛋白(OVA)-特异性T淋巴细胞的比例 ,在两个时期改变程度较小^［11］。这种恢复期Vβ 8.2⁺T细胞特异性下调的现象，进一步证实了前面的观点^［9］。1998年，他们检测了介导凋亡的蛋白，发现Vβ 8 .2⁺细胞中，Fas⁺和Fas-L⁺的细胞分别是Vβ 8.2^Fas⁺Vβ 8.2^Fas-L ⁺细胞的1.4～5.8倍和1.5～8.8倍，说明Vβ 8.2⁺细胞表达Fas 和Fas-L的频率高 ^［12］，进一步证实了“自身反应性Vβ 8.2⁺T细胞以凋亡的方式从靶器官中选择性消除”。其他学者用免疫细胞化学双标技术，在被动转移EAE的SJL/J雌性小鼠也证实了CN S中T淋巴细胞的凋亡^［8］。

　　Pender等检测了外周淋巴器官，发现主动诱导的EAE淋巴结中也有凋亡细胞的存在，但数量较少，主要局限于生发中心，即B细胞区。检测MBP-特异性T淋巴细胞在被动转移EA E的肠系膜淋巴结中的比例同样发现，症状明显时凋亡细胞比例较高，恢复期及恢复后比例逐渐降低，直至检测不出^［11］。MBP-特异性T细胞受体的转基因小鼠胸腺中也有 Vβ 8.2⁺ T细胞的凋亡^［13］。尚未看到关于脾内淋巴细胞凋亡的报道。

　　1.3　巨噬细胞及其他细胞　有研究者发现，一些非淋巴细胞的凋亡细胞，胞浆丰富，含有脂滴、空泡和吞噬的髓鞘碎屑，认为是巨噬细胞，并在电镜下得到证实^［7］。Bruno Bonetti等采用免疫细胞化学和TUNEL技术，在被动转移EAE急性期的小鼠中观察到环绕血管周隙的一些小胶质细胞也发生凋亡，但所占比例较低^［14］。后来证实，小胶质细胞比巨噬细胞更易于凋亡^［15］。

　　2　EAE中细胞凋亡的机制和影响因素

　　研究者们在确定EAE的CNS中有MBP-特异性淋巴细胞的凋亡后提出细胞凋亡的几种可能机制：(1)效应性T细胞完成功能后内源性程序引发的自我毁灭过程。但这一机制的可能性不大，因为细胞毒T细胞杀靶后可以再循环。(2)对致脑炎性T细胞有特异性定靶作用的 T细胞产生的细胞毒性（溶细胞性细胞间的相互作用）。(3)内源性皮质醇的释放。这一机制被广泛认可，并通过肾上腺切除后的EAE大鼠，观察到CNS内T细胞凋亡数量减少^［16］而得到进一步的证实。(4)激活诱导的细胞死亡。后来进一步研究发现，EAE恢复期间和恢复后，脱髓鞘病变释放的MBP增多，小胶质细胞表达MHC-Ⅱ类抗原也增多，致使新进入CNS的T细胞被激活，而此时Vβ 8.2⁺T细胞凋亡比例也升高^［12］，为这一机制提供了证据。

　　影响细胞凋亡的因素还很多，其中CNS的内部环境就是一个重要因素，因为研究中发现T淋巴细胞的凋亡仅限于CNS的实质。CNS的局部因素包括传导信号的失衡,细胞毒因子（TNF-α 、淋巴毒因子）、脑特异性激素和细胞毒T细胞的相互作用。此外，学者们认为脑内的星形胶质细胞和部分小胶质细胞也能促使T细胞凋亡^［14］。至于其机制，可能是由于星形胶质细胞和部分小胶质细胞属于非专一性抗原递呈细胞，缺乏协同刺激信号所致，属于激活诱导的凋亡。另外，过量的NO通过诱导型 NOS (iNOS) 在T细胞的凋亡中起重要作用^［17］。体外研究也证实，活性氧和NO能诱导MBP-特异性T淋巴细胞的凋亡^［18］。

　　巨噬细胞凋亡的机制及影响因素与淋巴细胞类似^［7］，但无Fas/Fas-L的参与^［15］。现只了解小胶质细胞的凋亡不通过Fas/Fas-L途径^［15］（这与有些学者的观点^［8］不太一致），其余无更多的阐述。

　　3　EAE中细胞凋亡的意义

　　很早就有人提出，淋巴细胞的克隆清除可能是EAE愈复和耐受的机制。现已十分肯定，这种淋巴细胞的“克隆清除”是以凋亡的形式发生的，并有大量研究提供了证据，证实细胞凋亡在EAE愈复和耐受形成中的作用。

　　研究者联合使用光镜、免疫电镜、免疫细胞化学、原位缺口翻译等技术研究发现，EAE早期阶段细胞凋亡较少，临床恢复时达到高峰，而此时损伤区中49%的T细胞凋亡了。在被动转移的EAE，也有类似的发现^［9］。这些除了提示人们淋巴细胞的清除与EAE的恢复有关外，还能解释以往的一些发现:CNS损伤区无髓磷脂-特异性T淋巴细胞的积累；外周血中这种特异性淋巴细胞比CNS多；MS患者缓解期外周血中髓磷脂自身免疫性T淋巴细胞的数量与正常人无明显不同。近年来，用免疫细胞化学和流式细胞分析检测介导凋亡的蛋白，进一步验证了细胞凋亡与EAE临床恢复的一致性^［12］，即Fas⁺和Fas-L⁺细胞自发病初期开始逐渐升高，恢复初期达高峰，而Bcl-2⁺细胞在整个病程中变化不明显。

　　对于急性EAE,CNS中 T细胞的凋亡与临床愈复的关系基本明确，而与人类MS更为相似的慢性 - 复发性EAE又如何呢？有人在相同条件下，同时检测急性EAE和慢性-复发性EAE病程中细胞凋亡的情况，并进行了对比。结果显示慢性-复发性EAE首次发作和再次发作时细胞凋亡情况与急性EAE类似：发病初期出现凋亡细胞，然后凋亡细胞数量逐渐增加，到恢复初期达高峰，随后又逐渐减少，几乎减少至零；再次发作时，凋亡细胞又逐渐增加，复发高峰时其数量也达高峰，然后又再次减少^［14］。

　　近年来，又有学者在碱性髓鞘蛋白反应性T细胞受体的转基因小鼠EAE恢复阶段发现CNS 中MBP-特异性T淋巴细胞的凋亡^［13］，从而更明确了自身反应性T 细胞以凋亡的方式自CNS清除是EAE愈复的机制之一。

　　EAE的CNS中淋巴细胞以凋亡方式发生的选择性清除，有助于减少MBP-特异性淋巴细胞的产生。但由于淋巴结内的前体能产生新的效应细胞，因而CNS内T淋巴细胞的急性清除不会产生长期耐受，而持续、低水平的凋亡则有助于耐受状态的形成。通过后来的研究又进一步提出，激活诱导的T细胞凋亡可能有助于机体在急性EAE后进入耐受状态^［12］。但这种耐受状态只针对再次用抗原和佐剂主动诱导的方式，而对于被动转移MBP-特异性淋巴细胞则不起作用。

　　此外，CNS内T淋巴细胞的凋亡还能尽可能减少脑损伤区以外的其他损伤。

　　巨噬细胞的凋亡在EAE的临床愈复中也有助于CNS炎症的消退，对缓解这一自身免疫性疾病很重要^［7］。少突胶质细胞的凋亡或损伤则在EAE的发病中起重要作用^{［5 ］}。

　　综上所述，EAE病程中自身反应性、CD4⁺Vβ 8.2⁺T淋巴细胞以凋亡的方式从CNS清除，是EAE愈复和耐受状态形成的机制之一。根据这一结论，再结合EAE时CNS中淋巴细胞凋亡的影响因素，就为我们通过治疗EAE进而治疗人类的MS，提供了一个新的方案。我们相信，在不久的将来，长期困扰人类的慢性自身免疫性脱髓鞘疾病——多发性硬化的治疗和预防复发将会有新的突破。

　　作者简介：王惠（1972-），女，河北省保定市人，在职硕士研究生。通讯地址：河北医科大学基础医学研究所神经生物研究室，石家庄 050017。联系电话(BP)：96151-77718。

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收稿日期：1999-03-15；修订日期：2000-05-24